1、温度效应：经研究证实在温育中的热力学梯度可能是根本原因。孔板的聚苯乙烯本身为不良热导体，在实验室的常规ELISA测定中，将板从室温（通常在25℃左右）置于37℃温箱，板也升温时，在外周孔与中心孔之间可能存在一热力学梯度。2、蒸发效应：虽然通常细胞培养箱中都会放置一盘双蒸水以维持培养箱中的湿度，但仍难达到多孔板中的湿度，特别是在培养箱经常开关的情况更是如此。由于位置效应，边缘孔的湿度较中间孔更低，水分挥发的现象就更为严重。这样就容易造成四周培养基的体积会明显少于中间孔，而四个角落的孔尤为严重