1861年南北战争爆发，北军招募平民军中医护人员。尽管玛丽·沃克是一名合格医师，由于身为女性，一开始她只被当作护士录用。直到1863年，她才被任命为平民身分的随军外科医师，也是美国第一位女性军医。

沃克曾在1861年第一次牛奔河之役、1862年弗雷德里克斯堡之役、1863年奇卡牟加战役深入前线工作，为军队及平民百姓治疗。1864年，她因担任情报人员而被南军俘虏，随后因两军交换战俘而获释。她继续在1864年的亚特兰大战役工作，其后亦被任命管理女子监狱及孤儿院。