把切好的质粒和目的基因放到一起进行连接。在此过程中，质粒不一定就和目的基因连接上，它也有可能会自己再重新连接上，这就叫载体的自身环化。这样的话我们就没能把目的基因导入载体质粒中。

如何避免质粒自身环化：

如果你使用的是酶切连接，选择不同黏末端的酶一般不会发生自身环化

如果是平端连接，则需要对载体去磷，也就是碱性磷酸酶处理。此时需要注意你的插入片段两边要有磷酸基团（可以引物合成时添加，也可设计平端的酶如EcoRV自己回来切），否则是连不上的。