称呼的语气不同：

欧尼桑是对兄长的尊称，称呼时是一种较为尊敬的语气而欧尼酱是对兄长亲切的叫法，称呼时是一种较为亲昵的语气。

2、称呼的对象不同：

欧尼桑既可以用来称呼自己的亲哥哥也可以用来称呼别人的哥哥，而欧尼酱一般只是称呼自己亲哥哥或关系比较好的哥哥。

3、偏重的人群不同：

欧尼桑比较偏重成年人的口语而欧尼酱比较偏重于孩子的口语。

4、日语写法不同：

欧尼酱——お兄ちゃん，欧尼桑 —— お兄さん。